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ChIP-seq
ChIP-seq

一、产品概述

1.1 什么是ChIP-seq 

ChIP-seq技能联合染色质免疫共沉淀技能(Chromatin ImmunoprecipitationChIP)与高通量测序,是研讨体内卵白质与DNA互相作用的无力东西,通常用于转录因子联合位点或组卵白特异性修饰位点的研讨。

1.2 产品功效

ChIP-seq技能是将ChIP与高通量二代测序联合,从基因组范畴内检测组卵白、转录因子等卵白质联合的DNA区段。研讨转录因子及其他与染色质相干的卵白怎样影响表观调控,检测在一些生物历程与疾病中,DNA与卵白质互相作用调控基因表达的紧张性。联合生物信息学剖析,可以找到转录因子卑鄙调控的靶基因,为进一步分析生物学机制提供根据。      

1.3 技能上风 

1. 全基因组掩盖:ChIP-Seq可在全基因组范畴单碱基程度对卵白联合位点举行挑选与判定。

2. 高敏捷度:每个样本可取得数百万条的序列标签,可发明研讨基因组上有数的卵白联合位点。

3. 高准确率:可取得高程度的信噪比数据,正确区分真实事情与乐音,准确定位卵白联合位点。

       
1.4 实行简介 

1.4.1实行原理     

 起首经过染色质免疫共沉淀技能(ChIP)特异性地富集目标卵白联合的DNA片断,并对其举行纯化与文库构建;然后对富集失掉的DNA片断举行高通量测序。
      
 使用:(1)判别DNA链的某一特定地位会呈现何种组卵白修饰;

     (2)检测RNA polymerase II及别的反式因子在基因组上联合位点的准确定位;

     (3)研讨组卵白共价修饰与基因表达的干系;

     (4CTCF转录因子研讨。        

1.4.2 实行流程

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取得样品后,起首是细胞核的提取。细胞样品无需此操纵,构造样品要颠末研磨处置,将构造块处置成单个细胞或细胞核。随后是卵白质和DNA的交联,使得转录因子严密的联合在与DNA互相作用的地位,便于后续操纵。紧随着是DNA片断化处置,这一步将DNA随机打断,既照顾了测序仪的读长要求,也使得测序愈加准确。抱负的片断长度为1-3个核小体(150-500bp)。片断化处置之后的样品,颠末特异性的抗原抗体联合反响被免疫沉淀上去,而没有联合的DNA卵白质复合体则被洗失。
      IP上去的DNA经过毗连测序讨论和可以辨认的条码序列,被制备成了可以用于二代测序的文库。同时片断化后的总DNA也被制备成文库,作为剖析的参考。

 

二、j9九游生物到场完成的典范案例

2.1 转录因子的ChIP-seq案例
        案例一

        EglN2 associates with the NRF1‐PGC1α complex and controls mitochondrial function in breast cancer. (EMBO J, 2016) 
       EglN2/PHD1是一个对乳腺癌产生有紧张作用的氧感知器(oxygen sensor)。越来越多的研讨标明在氧感知(oxygen sensing)和线粒体作用上两者有功效上共同(cross talk),而且两者在维持肿瘤生长上都有很要害的作用。这篇文章向j9九游展示了EglN2敲除会低落在常氧和缺氧形态下乳腺癌中线粒体的呼吸。进一步整合剖析RNA-seqEglN2在缺氧形态下ChIP-seq数据 j9九游发明:NRF1EglN2激活的基因上有motif 富集,这表示了NRF1大概是EglN2的共联合因子(binding partner)。进一步,j9九游经过ChIP-seq数据验证了 EgLN2NRF1的互相联合。机制上,经过在染色质上构成EglN2/PGC1alpha/NRF1激活复合体,EglN2激活了FDXR的转录并坚持了线粒体的功效。进一步,FDXR作为EglN2的一个卑鄙靶基因(effector),招致了乳腺癌的产生in vitro/ in vivo. 作者的发明表示了EglN2调控了ERalpha阳性乳腺癌中线粒体的功效。

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2.1 案例实行图

 

案例二

Inactivation of PBX3 and HOXA9 by down-regulating H3K79 methylation represses NPM1-mutated leukemic cell survival (Theranostics,2018)

约1/3的急性髓系白血病(AML)患者存在NPM1 渐变(NPMc+),但,关于NPM1渐变在AML发病中的分子机制尚不明白。本研讨起首剖析了TCGA数据,标明在NPMc+白血病中PBX3和HOXA9存在高表达,在白血病发病历程中有紧张作用。为了验证NPM1渐变能否可以经过表观遗传学来调控白血病的发病历程,检测了NPMc+白血病细胞中H3K4me2、H3K9me2、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3的甲基化程度,以为H3K79的甲基化与NPMc+的转录活性有关。为了验证PBX3和HOXA9的表达能否遭到H3K79甲基化的影响,经过ChIP-seq剖析NPMc+ MEFs/WT和OCI-AML2/OCI-AML3的H3K79me2发明HOXA9的表达遭到H3K79me2间接调控,但PBX3没有间接作用。PBX3是HOXA的帮助因子,经过敲除HOXA9,发明PBX3的表达明显下调,但没有影响H3K79me2,而PBX3的敲除,没有影响HOXA的表达。最初,验证DOT1L小分子克制剂EPZ5676的作用机制,发明会惹起HOXA9,PBX3 和H3K79me2的下调,诱导NPMc+白血病的自噬,DOT1L经过克制组卵白H3K9甲基化从而到场NPMc+白血病。

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2.1 案例实行图



2.2 组卵白修饰的ChIP-seq案例
        Conditional Knockin of Dnmt3a R878H inituates acute myeloid leukemia with mTOR pathway involvement  (PNAS, 2018) 
      Dnmt3a是造血体系中表观遗传学的修饰基因和癌症的克制基因。Dnmt3a 878H是急性髓样白血病(AML)中罕见渐变体。本研讨接纳条件性敲击的办法发明Dnmt3a R878H不敷以惹起AML。经过单细胞测序(single-cell RNA-seq)联合甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-seq)发明Dnmt3a 
R878H/WTDnmt3aWT/WT的低甲基化和超甲基化地区,经过基因正文发明差别甲基化地区(DMRs)的富集通路到场多能性干细胞和慢性粒细胞白血病(CML)调控,团结RNA-seq发明Dnmt3a R878H/WT诱导的低甲基化有助于mTOR上调。MeDIP剖析表现白血病细胞的mTOR基因主体低甲基化。经过RNAi等发明mTOR的上调使CDK1的程度增长,CDK1介导EZH2的磷酸化程度增长来克制H3K27me3的甲基化程度。经过ChIP-seq剖析Dnmt3aR882H/WTDnmt3aWT/WTH3K27me3发明Dnmt3aR882H/WTH3K27me3甲基化程度和富集水平低于Dnmt3aWT/WT。明白mTOR pathway的激活作为一个疾病机制的要害调治剂而且可以经过mTOR来克制Dnmt3a渐变体相干的白血病的潜伏医治效应。

 

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2.2 案例实行图

 

三、其他使用案例

       案例一
       FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 activates SEPALLATA2 but inhibits CLAVATA3 to regulate meristem determinacy and maintenance in Arabidopsis. (PNAS, 2016)
       动物分生构造对动物构造和器官的构成是须要的。转录因子FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 (FHY3)是已知的拟南芥生长阶段发扬多重作用,但它的功效在生殖生临时是不晓得的。作者经过对fhy3渐变体举行表型剖析发明,FHY3在花分生构造决议和茎端分生构造的维持中都具有紧张作用。经过ChIP-seqRNA-seq数据剖析发明在花发育历程中有238FHY3间接联合并转录调控的靶基因(此中138个在fhy3-68渐变体中是转录上调的,100个是转录下调的)。依据特异联合位点,作者发明了52个花特异的FHY3靶基因,此中63%33个基因)在fhy3-68渐变体中是上调的,进一步表现FHY3在花发育中的转录克制作用。作者进一步证明了CLV3SEP1SEP2都是FHY3的靶基因。在茎尖分生构造中,FHY3间接克制CLV3,从而调控WUS来维持干细胞池。在花分生构造中,FHY3间接克制CLV3,并且激活了SEP2来促进花分生构造决议。并且,作者经过遗传剖析证明了两个分生构造创建和维持的要害因子WUSCLV3作用于FHY3的卑鄙。

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3.1 案例实行图

      

        案例二    

    H2A monoubiquitination in Arabidopsis thaliana is generally independent of LHP1 and PRC2 activity. (Genome Biology, 2017)
    文章经过拟南芥H3K27me3 和H2AK121ub的ChIP-seq实行和数据,答复了一个悬而未决的动物范畴表观遗传的题目,究竟组卵白修饰H2AK121ub能否必要转录因子PRC2的活性。经典模子以为,PCR2介导的H3K27me3是 招募PRC1构成H2AK121ub的不行或缺的一步,也便是说PCR2的活性是H2AK121ub构成所必需的。但作者发明,在许多状况下,普遍存在的组卵白修饰H2AK121ub与H3K27me3的散布有关(H3K27me3是由PCR2介导产生的)。经过一系列后续实行,作者以为在很大水平下去说 H2AK121ub的构成与PRC2的活性有关。

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3.2 案例实行图

       

        案例三      

        SETDB1 modulates PRC2 activity at developmental genes independently of H3K9 trimethylation in mouse ES cells (Genome research, 2015IF=11.3)
       小鼠胚胎干细胞中SETDB1独立调治H3K9me3历程中发育相干基因PRC2活性 
       SETDB1是一种促进H3K9 甲基化修饰的组卵白甲基转移酶。作者起首用ChIP-seqH3K9me3做了4个反复,联合古人的SETDB1ChIP-seq 实行数据举行比对,失掉了两种SETDB1peaks位点:solo peaksensemble peaksensemble peaks位点左近有H3K9me3峰值,而solo peaks左近没有。对solo peaks位点靶基因举行GO剖析,发明大局部基因富集在神经发育调治功效中,而这局部基因又与中心卵白复合体(PRC2)互相联系关系。PRC2联合位点左近一样平常陪同着丰厚的H3K27me3修饰,H3K27me3修饰会克制SETDB1修饰H3K9me3。经过SETDB1敲除,发明H3K27me3增加,神经分解失掉促进。

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3.3 案例实行图

       

       


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